脂溶性维生素主要包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K，它们不溶于水，而是靠脂肪吸收。维生素E主要来源于植物油（如葵花籽油、玉米油、大豆油、芝麻油、橄榄油）、杏仁、西兰花、羽衣甘蓝等。存在较多维生素A的食物有鱼肝油、动物肝脏、胡萝卜等深色蔬果、蛋黄、牛奶等。维生素D的天然来源有深海鱼、蛋黄、牛奶、豆浆等。维生素K有K1和K2两种，其中K1是植物型，常见于绿叶蔬菜如菠菜、甘蓝、西兰花、芥蓝、生菜、香菜等。而K2则是发酵型的，主要来源于纳豆、奶酪、酸奶等食物中。
以维生素A为例子，它也称为视黄醇，化学结构中包含了β-紫罗兰酮环和1个多烯脂肪链，链末端具有1个羟基（-OH），侧链上还有4个共轭双键。从这个结构上来分析，有极性基团，也有非极性的，主要表现为非极性或弱极性，还有紫外吸收的特点。因此，HPLC测定它的含量，可采用C18色谱柱吸附，紫外检测器设置对应波长如325nm。维生素A分子种含有多烯醇侧链，比较不稳定，容易吸收紫外光而发生裂解，还会被空气所氧化，特别是加热和金属离子存在时更容易变质。因此，在样品提取的过程种，需要避光操作。
HPLC测维生素A含量时，前处理要经过皂化-提取-净化-浓缩步骤。皂化是用碱性溶液（如KOH的乙醇溶液）在水浴（85℃）条件水解样品中的甘油三酯，释放出游离态的维生素A、甘油和脂肪酸盐。皂化后需要立即用有机溶剂（如乙醚）萃取，避免维生素A发生氧化。称取2g样品放入棕色的离心管中，加入10ml的无水乙醇，50%的氢氧化钾20mL（氢氧化钾和乙醇的比例，根据具体样品来确定）。另外，还需要再加入抗氧化剂（BHT）保护维生素A，BHT的含量一般是0.1g/50ml的比例。充分混合后振荡1min，放入85℃水浴中避光皂化30min。常规的食品、血清等样品一般选择50-85℃水浴，如果是特殊的如肝脏，可能要到80-90℃，确保皂苷完全。用石油醚进行液液萃取，重复3次，合并萃取液。用超纯水洗涤至中性，加入1g无水硫酸钠吸收微量的水分。将上清液，在室温下用氮吹浓缩，过0.22um膜过滤。
精密称取一定量各个标准品于5mL棕色容量瓶中，然后加入适量甲醇超声溶解后用甲醇定容至刻度线，摇匀、使之成为1mg/mL的单标储备液，-20℃保存。再精确移取一定量各个单标储备液于5mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，使之成为不同浓度的混合标准中间液，-20℃保存。流动相用甲醇和水（95:5）等度洗脱，流速1ml/min，柱温30-40℃，进样量10-20uL（根据样品的浓度调整）。