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高效液相色谱(HPLC)法测定生物胺

2026-01-08

生物胺主要来源于肉类(因储存不恰当,如温度过高,微生物污染,分解蛋白质为氨基酸,再脱羧生成生物胺),植物性食品(如杏仁、豆类、香蕉、番茄、菠菜,含有较高浓度的氨基酸前体,在成熟和发酵过程会被转化为生物胺),食品加工污染(在食品生产链中,设备、空气、人员等都可能会携带微生物,污染原料或半成品,导致非预期的生物胺生成),水产品(虾类、鱼类等富含蛋白质,在冷藏不当或储存时间过长,腐败菌大量繁殖,催化氨基酸脱羧,生成组胺、腐胺、尸胺等),奶酪,酒类(如米酒、啤酒、葡萄酒),酱油,发酵香肠等,在乳酸菌和酵母菌等微生物作用下,通过氨基酸脱羧酶将游离氨基酸转化为生物胺。

按氨基酸的数量来分,生物胺有单胺(含1个氨基,如组胺、酪胺、色胺)和多胺(含2个或2个以上氨基,如腐胺、尸胺、精胺、亚精胺)。按来源来分,有内源性生物胺和外源性生物胺。按结构来分,有脂肪族胺(如腐胺、尸胺、精胺、亚精胺),芳香族胺(酪胺、苯乙胺),杂环胺(组胺、色胺)。生物胺具有多方面的作用,比如组胺能召集免疫细胞对抗感染,调节肠道功能,参与睡眠-觉醒周期调控。酪胺通过抗氧化作用影响血压和代谢,色胺影响情绪和睡眠。

HPLC测生物胺(比如,生物组织中的腐胺),可采用酸溶液提取法,比如2.5%高氯酸。将样品进行粉碎,精确吸取0.2ml或0.2g样品,加入0.2ml预冷的2.5%高氯酸。高氯酸的强酸性有助于从样品中将生物胺解离出来,同时能破坏生物胺和蛋白质结合的氢键和离子键,让蛋白质变性而沉淀下来,从而释放出生物胺。接着采用低温超声的方法提取半个小时,用10000r/min离心10min,取上清。生物胺缺乏共轭体系,分子结构通常是以脂肪链或简单芳香环来连接氨基,紫外吸收较少,需要在生物胺分子上引入强紫外信号,也就是衍生化处理。

精确移取提取液样品0.35mL至于15ml 离心管中,加入1ml 2mol/L NAOH 溶液、20μL 苯甲酰氯,在混匀器涡旋 30s,置于37℃水浴中反应 20min,期间每隔5min 涡旋30S。衍生结束后,加入2ml 饱和氯化钠溶液,2ml 乙酸乙酯,振荡混匀,静置,取全部上清液转移至另一离心管中,重复提取一次,合并两次萃取液,40℃氮吹至干,加入0.5ml甲醇溶解,过0.22μm 滤膜待测。液相色谱用C18色谱柱,常规250mmx4.6mm,5um的。柱温40℃,紫外检测器波长254nm,流速1ml/min,进样量20ul(根据实际浓度进行调整),流动相采用乙腈和0.02mol/L乙酸铵,梯度洗脱。


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