天然人参中的皂苷种类繁多,主要分为三类:人参二醇型(如Rb1、Rb2、Rc、Rd)、人参三醇型(如Re、Rg1、Rg2)和齐墩果酸型(如Ro)。不同品种的人参所包含的皂苷种类和含量是有差异的,主要采用高效液相色谱(HPLC)或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定它们的含量。HPLC通过C18色谱柱吸附,用乙腈和0.1%磷酸水溶液梯度洗脱。LC-MS/MS通过高分辨率的C18色谱柱吸附,乙腈和0.1%甲酸水为流动相,从高比例水相开始梯度洗脱,用对应人参皂苷种类的离子对进行定性定量,用标准曲线计算含量。如果要定性的话,需要有比较完善的数据库。
人参皂苷的极性差异还是比较大的,极性大的易溶于水,极性小的微溶于水。根据调节流动相的比例改变流动相的极性,来接近于单个皂苷的极性,根据相似相容的原理,从色谱柱上有序洗脱下来。人参皂苷的极性是跟糖基的类型、数量、连接位置有关的,糖基越多,极性就越强。人参皂苷的糖基(鼠李糖、葡萄糖等)通过糖苷键链接到苷元的特定位置上,比如C-3,C-6,C-20。苷元是由30个碳原子组成的四环三萜,是皂苷骨架的核心。
判断分子是不是极性比较重要,要选择合适的色谱柱来吸附它,需要调节流动相中的比例来改变极性,进行有效洗脱。中心原子化合价法,就是看一个分子的中心原子,它的化合价绝对值是否和外层的电子数相同,就是一个人双手双脚都用上了,没有空余的地方,就是非极性的了。但凡有一个手或脚是空着,就变成了极性了。孤对电子法,就是看中心原子有没有孤对电子,没有的话就是非极性的,如果有的话就是极性分子。其实也很简单,就像其他人都有结合对象了,它一个人还空着,就是极性的了。比如H2O,氧原子上有2对孤对电子,它们位于氧原子的sp3杂化轨道上,不参与成键。这些孤对电子对成键的电子有排斥作用“你们都滚一边儿去”,进一步压缩了O和H共价键的键角到104.5℃,成V形弯曲,并增强了分子的极性。
人参皂苷的糖基上含有多个羟基(-OH),羟基是亲水性的基团,能和水分子形成氢键,从而增强了分子整体的极性和亲水性。皂苷也并不是纯极性的,它还含有非极性的基团,如皂苷元部分,表现为疏水性和非极性的特点。因此,可以用C18的色谱柱来吸附,并用乙腈和水来洗脱。如果极性远大于非极性,更容易被洗脱出来,可在流动相的水相中加入0.1%甲酸来增强保留,抑制离子化,减少拖尾,提升分离效率。要测具体多少种类的皂苷,就需要改变洗脱梯度、柱温、流速、进样量等来进行调节。