超氧化物歧化酶,简称为SOD,它是一种抗氧化酶,专门清理有害的自由基,保护细胞免受氧化损伤。它的活性位点核心在于其金属离子的类型,如Cu2+/Zn2+,Mn2+或Fe2+。金属离子在催化过程中发生氧化还原反应,比如Cu2+⇌Cu⁺,介导电子转移。部分SOD(如Mn-SOD)具有疏水残基构成的通道,底物通过这个通道就可以接近活性中心。活性中心通常具有特定的几何构型,如畸变的平面四方形或三角双锥。金属离子还可以和蛋白质中的组氨酸、天冬氨酸等残基配位,形成稳定的活性中心,但可能会受pH值等因素的影响。
SOD的氧化还原过程,是催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应,依赖金属离子在+2和+3价态间的可逆转换。以Cu-SOD为例,活性中心的Cu2+首先获得O2-的一个电子,被还原为Cu+。随后,Cu+将电子转移传递给另外一个O2-,自身重新被氧化为Cu2+。这个过程使得两个O2-分别转换为氧气(O2)和过氧化氢(H2O2)。因此,测定H2O2的变化,可从侧面来证明SOD的活性。Mn-SOD、Fe-SOD与Cu-SOD的作用机制是相似的,这个循环的周转率是非常高的(每秒10⁹次),远超过其他抗氧化物质的效率。
检测植物体内的SOD活性,通常是用分光光度法。核黄素在光照下产生超氧阴离子自由基(O2-),后者能将NBT(硝基蓝四氮唑)还原为蓝色甲臜,在560nm波长处有强的吸收光。SOD能催化O2-发生歧化反应,从而抑制NBT的还原,使得蓝色变浅。通过测定吸光度的变化,可计算出SOD的活性,抗氧化的能力。
首先,要将植物组织用预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)研磨均匀,4000r/min离心10分钟后取上清液,在试管中加入PBS、NBT、核黄素、甲硫氨酸、酶液和EDTA-Na2,混匀,在4000lux光照下反应15-20min,之后,迅速遮光终止反应,用不加酶的试管液作为空白对照,在分光光度计的560nm波长处测定它的吸光度值,做个标准曲线,计算出SOD活性,通常以抑制NBT光还原50%所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。