氨基酸能够被水解，是因为分子结构中的肽键（-CO-NH-）在特定的条件下能够被断裂。20种不同种类的氨基酸，通过肽键连接而形成蛋白质。其中，氮原子带有孤对电子，容易和氢离子（H+）结合形成质子化中间体。强酸（如6M的盐酸）解离的H+和肽键的氧、氮原子结合，使肽键碳原子带正电。水分子中的氧原子会进攻带正电的碳原子，形成过渡态。这个过渡态不稳定，会导致C-N键断裂，生成两个新的氨基酸片段。
水解氨基酸有两种方法，酸水解法和碱水解法。其中，酸水解出来的是常见的17种氨基酸，碱水解的是色氨酸。以酸水解为例，使用浓盐酸（6M的HCl）在高温（105-110℃）烘箱下催化肽键断裂，形成游离的氨基酸。这种方式水解的比较彻底，可以将所有的肽键都断裂，且不引起消旋。但也是有缺点的，就是色氨酸会被破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺被水解。色氨酸中的吲哚环结构在强酸和高温条件下不稳定，容易发生质子化导致开环反应，形成呋喃树脂等降解产物，而在碱性条件相对稳定，不会被破坏，因此要用碱性方法来水解色氨酸。碱解方法，就是用强碱（如5M的NaOH）高温处理，导致肽键断裂而游离出色氨酸。
酸解出来的17种氨基酸，要经过衍生化，才能在紫外检测器下测出来。衍生剂可以用DNFB（2,4-二硝基氟苯），它通过亲核取代反应和氨基酸的α-氨基结合，生成稳定的黄色DNP-氨基酸衍生物。这个衍生反应，要在pH8-9的弱碱条件下进行，具有高度的特异性。衍生反应在60℃水浴条件下，可加速反应，且衍生更完全。衍生过程要避光进行，冷却到室温时，要加入pH=7.0的磷酸缓冲液，充分混合。最后，过0.22um膜过滤。
氨基酸中有氨基和羧基，要用0.02mol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠作为缓冲盐，乙腈为有机相。17种氨基酸，需要用梯度进行洗脱。从低比例的有机相，比如10%乙腈开始，到70%乙腈，先跑40分钟。看色谱峰是否全部出来，色谱峰是否有堆积，可在堆积多的地方多停留一点时间，或减小洗脱斜率。
