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土壤纤维素酶活性测定

2025-12-03

纤维素酶是一类专门催化纤维素水解生成葡萄糖的多组分酶系,主要有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成,相互协作,共同完成任务。外切葡聚糖酶破坏纤维素的结晶结构,使长链分子末端游离。内切葡聚糖酶是随机裂解β-1,4-键生成低聚糖,β葡萄糖苷酶是将纤维二糖等低聚糖分解为葡萄糖。因此,它们三个谁都离不开谁。纤维素酶可应用于纺织业、农业、造纸、食品、环保等行业。

在土壤中,纤维素酶可分解植物残体中的纤维素,将有机碳转化为可溶性糖类。还能促进有机质的分解,形成腐殖质,增强土壤团聚体的稳定性。在纤维素中包裹的氮、磷等微量元素,也会随着纤维素的分解而被释放到土壤中,成为植物生长重要的营养元素来源。研究土壤纤维素酶活力,可判断土壤的肥力,增强农业管理。纤维素酶是由17-18种氨基酸按特定顺序构成的,具有蛋白质的四级结构特征。活性中心的三维构象使其能专一性结合纤维素分子,并通过"诱导契合"机制高效催化水解反应。

测定土壤中的纤维素酶活力的方法,主要采用分光光度法(DNS法)。

使用分光光度法测定,样品中的目标化合物,将它转变为能够发光的,可被外在设备检测到的物质。纤维素酶将纤维分解为还原糖,和DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)发生显色反应,在特定的波长下测定它的吸光度值。吸光度和颜色的深浅有直接的关系,颜色的深浅和物质的含量也是呈正相关的。通过一些列浓度的标准品,测定吸光度值,拟合出对应的标准曲线,得到回归方程,相关系数要符合要求,确保数据的可靠性。

先称量5g或10g的新鲜土壤,加入15ml醋酸缓冲液和15ml羟甲基纤维素钠溶液(1%浓度,pH5.5缓冲液),50℃恒温培养24h,过滤后取滤液稀释备用,同时设置空白对照。取2ml滤液,加入2mlDNS试剂,沸水加热5分钟,终止反应。冷却后,在540nm波长处测定吸光度值,可设置几个平行。对葡萄糖标准溶液进行梯度稀释5-7个点,记录它们的浓度和测定的吸光度值,绘制标准曲线。根据样品的吸光度值,计算出还原糖的含量。根据公式,可计算出纤维素酶的活性(ug/g*h)。


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