番茄红素是一种从番茄、南瓜、西瓜等红色蔬菜中提取出来的植物天然色素(类胡萝卜素),它的化学结构中含有11个共轭双键和2个非共轭双键,没有芳香环。它有共轭双键,就说明有紫外吸收能力,如果用液相色谱测定,可以用紫外检测器设定对应的波长。极性分子具有永久的偶极矩,非极性分子的偶极矩为零。番茄红素的碳氢结构是对称的,没有出现电负性差异导致的电荷偏移,没有孤电子对或不对称性,是非极性化合物,可以用C18色谱柱来吸附。
番茄红素易溶于二硫化碳、乙醚、氯仿,微溶于甲醇、乙醇、乙腈,不溶于水。番茄红素对光、热、氧及金属离子敏感,易降解。因此,在样品提取的过程中,可用乙醇溶液和0.1%BHT(抗氧化剂)来提取,低温避光操作。在提取的过程中,温度不要超过40℃,否则容易被氧化或异构化,通常是在25℃进行混匀或振荡3-4h。如果乙醇溶解度不够,可用乙醚或石油醚等非极性溶剂提取,之后通过氮吹浓缩,甲醇和0.1%BHT复溶,定容过滤。
用常规的C18色谱柱是没问题的,但流动相的选择是比较重要的。番茄红素不溶于水,那就要用甲醇和乙腈来进行洗脱。通过改变其中一个有机相的比例,来改变流动相的极性,从而达到将番茄红素从色谱柱固定相吸附位点上洗脱下来的目的。乙腈洗脱能力更强,更适合于疏水性化合物,甲醇对极性化合物的洗脱更适合。因此,洗脱番茄红素,乙腈是主力,甲醇是辅助。如果样品中仅仅是测番茄红素,可通过优化流动相的比例,等度洗脱(如乙腈:甲醇=65:35)。
等度洗脱就是固定流动相的比例,不随时间的变化而变化。番茄红素在有机相中是分配比例的,当在某个临界点的时候,能够达到有效洗脱。可以把色谱图中一个个的峰,当做是一个个的物质。在某个时间段内,虽然有机相比例是一样的,有的峰先出来,有的峰后出来,这就取决于物质和色谱柱固定相吸附能力。番茄红素的紫外吸收波长为445nm,可设置波长并记录信号峰,结束后可以对峰面积进行积分处理。标准品可以用二氯甲烷等有机溶剂来溶解,梯度稀释,得到对应的色谱峰,对各个峰面积进行积分,拟合出标准曲线,得到回归方程,相关系数R2要大于0.999并接近于1。还需要验证一下定量限,确保检测的结果在定量限范围内,保证结果的有效性。