从化学结构上来看，油菜素内酯的核心骨架是甾体母核（A、B、C、D环），D环通过氧原子和B环形成7-氧杂六元环结构，官能团有羟基、内酯环、甲基可增强它的疏水性。然而，油菜素内酯是极性化合物，分子结构中的羟基和酯基使其具有亲水性。油菜素内酯主要分布在植物的分生组织（根尖、茎尖）和幼嫩组织。
油菜素内酯是极性的化合物，如果用C18色谱柱的话也不是不可以，通过添加酸的方式来增强保留，也可以用聚合物基质柱来增强对极性化合物的保留。如果用常规的HPLC来测定的话，由于它是极性化合物，可提高有机相（如乙腈）的比例到70%-80%，水相降低到20-30%来洗脱。提高有机相，也是在增加流动相的非极性，从而增加油菜素内酯的保留时间。如果同时测其他种类的化合物，可以用流动相梯度洗脱测定含量的。如0.1%甲酸和乙腈，通过标准品先跑一遍，确定油菜素内酯的保留时间。再跑一遍样品，由于样品的情况比较复杂，如果能直接出峰是比较好的。如何出峰比较杂，且分辨不出来，需要调整梯度洗脱斜率，逐步的分离出来。
在它的化学结构中，甾体骨架的α,β-不饱和酮基（如A环）通过π-π电子跃迁产生紫外吸收，共轭效应使吸收峰红移到240nm附近，HPLC测定油菜素内酯的含量，可用紫外检测器（UV），波长为222nm。如果用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS），需要更换更细更短的色谱柱（如C18，2.1×100mm，1.7μm），提高分辨率。油菜素内酯的分子结构中含有羟基和酯基，在流动相（如0.1%甲酸）中易形成稳定的[M+H]+加合离子，采用正离子模式扫描，ESI离子源，多反应监测模式（MRM）。
油菜素内酯是属于植物激素的一种，在植物组织中的含量比较低，可以用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）更准确的测定出来。通过油菜素内酯的离子对进行定性和定量，标准曲线，计算含量。