辣椒素的分子中含有苯环和长碳链，是一种非极性的化合物，具有疏水性。它易溶于乙醇、乙醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，而难以溶于水。既然，辣椒素是一种非极性化合物，就可以用C18的反相色谱柱吸附。C18色谱柱，常用的是250mmx4.6mm，5um的规格，对应的流速为1ml/min，进样量10ul，根据实际出峰的情况进行调整。柱温的话，一般采用25-35℃。
辣椒素是一种酚类衍生的酰胺，它的分子结构中含有苯环，里面有共轭双键。共轭双键是两个双键被一个单键隔开而形成的，如C=C-C=C，共轭双键数量越多，电子跃迁所需要的能量就越少，导致吸收峰向长波方向移动。共轭分子中π电子离域的一维有效长度，也称为势箱长度，它和共轭键的物理长度相关，可通过公式L=（k+2）x1.4A计算出来，其中k为共轭双键数目。通过一维势箱模型公式，可计算出来最大吸收波长。
在液相色谱检测过程中，通过二极管阵列检测器（DAD），直接扫描其紫外光谱，确定λmax。辣椒素的紫外吸收波长是280nm，可采用紫外检测器（180-900nm）检测。紫外检测器确保灯源能量的充足，确保流通池没有污染，测出来的色谱峰更准确。
流动相是比较关键的，可选择甲醇-水为流动相。在反相色谱中，增加有机相的比例（如甲醇、乙腈）会导致水相的比例减少，从而降低整个流动相的极性。当流动相的极性降低的时候，洗脱能力增强，色谱峰的保留时间缩短。辣椒素是一种弱碱性化合物，等电点pKa大约为10.25，在常规的液相色谱流动相pH（2-8）范围内，辣椒素是以非解离的分子形式存在，不需要再添加缓冲盐。另外，辣椒素和色谱柱固定相的吸附，依赖于疏水的相互作用，而不是靠离子交换作用，因此吸附和洗脱受pH值影响比较小。