ATP的中文名为腺嘌呤核苷三磷酸，简称为三磷酸腺苷。它的化学结构是由1个腺嘌呤，1个核糖和3个磷酸基团组成的。因为分子中含有多个磷酸基团，在生理条件下带3-4个负电荷，这些电荷在空间上相互排斥且分布不对称，导致正负电荷中心不重合，形成明显的偶极矩，导致高能磷酸键不稳定。ATP是一种极性化合物，使用液相色谱测定时，要用亲水性的色谱柱或改性的C18色谱柱，以增强极性化合物的保留。另外，反相色谱中，在流动相中添加磷酸二氢钠的酸盐，也可以增强化合物的保留。
三磷酸腺苷（ATP）含有多个磷酸基团，其中pK2和pK3是主要的解离位点，pK2为4.00，pK3为6.48，当环境的pH值接近等电点时，ATP的解离度为50%，在液相色谱中会产生峰分叉或拖尾。在pKa±1.5范围外，可确保化合物以单一形态存在，流动相的pH通常为6.5-7.5，可确保ATP在色谱柱上获得良好的保留和分离效果。因此，在流动相中要加入磷酸二氢钠缓冲盐，使用磷酸盐要注意它的浓度不应太高，容易在色谱柱和管路中产生沉淀造成堵塞。在碱性环境中，ATP分子的磷酸基团会进一步发生解离，导致分子结构不稳定，容易出现水解反应，生成ADP和Pi。
ATP分子中的腺嘌呤环和嘧啶环都含有共轭双键结构，这些共轭双键的电子在紫外光照下发生π-π跃迁，吸收260nm波长的光。因此，用紫外检测器，设置波长260nm可记录到ATP的信号值。如果单独测ATP的含量，因为它是极性化合物，可溶于水，可用含有0.035mol/L磷酸二氢钠（pH=6.8）或0.02%冰醋酸-甲醇作为流动相等度洗脱。如果样品中的化合物比较复杂，可使用梯度洗脱的方式，根据出峰情况来调整流动相比例和洗脱斜率。
合适的流速会让基线跑的更平直，峰和峰之间有效分离开。流速的来源是液相色谱的泵提供压力来维持的，它更考虑了色谱柱的容量和分离需求。一般规格的C18色谱柱，使用1ml/min的流速，进样量也在10-20ul。如果浓度低，可适当的提高进样量，不能超过柱容。如果浓度高，可少进一点，或者先进行稀释，再按要求的进样量进样。进样的方式主要是自动进样，设置好进样的体积，按程序完成进样。另外，需要注意进样瓶的体积，如果样品溶液量不够，可用内衬管，确保进样针能吸到里面的溶液，且完成规定体积的进样。