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生物胺含量的测定方法

2025-11-20

生物胺是一类含氮的低分子量生物活性有机化合物,按结构来分类,包括脂肪族生物胺(腐胺、尸胺、精胺和亚精胺等,不含芳香环或杂环)、杂环生物胺(组胺、色胺等,分子中含有杂环)、芳香族生物胺(酪胺、苯乙胺等,分子中含有苯环结构)。按氨基的数量来分类,包括单胺(组胺、酪胺、色胺等)、二胺(腐胺、尸胺等)、多胺(精胺、亚精胺等)。生物胺的碱性特征使其易与酸结合,在食品腐败或发酵过程中由氨基酸脱羧生成。

以组胺为例,它的化学名称为2-氨基乙基咪唑,化学结构中含有一个咪唑环和一个乙胺测链,咪唑基团可接受质子带正电荷,使得组胺整体上呈碱性。乙胺侧链是极性的,属于亲水性的。组胺的化学结构中不含共轭双键的结构,本身没有紫外吸收的特征。如果要用液相色谱的紫外检测器,需要对它进行衍生处理。在实际分析中,一般会使用丹磺酰氯等衍生剂来和组胺反应,生成具有紫外吸收的衍生物。

液相色谱检测组胺含量,前处理主要包括称量、溶解、分离、衍生化、过滤等步骤。

提取的过程,先精准的量取一定体积的样品溶液,加入同体积的2.5%高氯酸水溶液,低温超声30min,在10000r/min的离心作用下坚持10min,就可以完成了。衍生的过程是在提取液中,加入适量的2mol/L的NaOH溶液,苯甲酰氯混匀,在37℃的水浴上反应20min。等衍生结束后,加入一定的饱和氯化钠和乙酸乙酯,混匀并静置,萃取上清,40℃氮吹至干,然后加入一定量的甲醇溶解定容,0.22um膜过滤。

液相色谱条件,主要包括进样量、色谱柱及柱温、缓冲盐、流动相、洗脱梯度及流速等。进样量和流速一般是由色谱柱的类型和柱容来确定的,比如C18反相色谱柱,250mm长,4.6mm内径,5um粒径,常规推荐的进样量是10-20ul,流速为1ml/min。如果用UPLC或LC-MS,需要更短的粒径更小的色谱柱,进样量和流速会更低,以满足更高分离度的要求。流动相是用的乙腈和水,缓冲盐是0.02mol/L的乙酸铵,保持碱性pH值,避免出现化合物解离,影响峰形和定量分析。梯度洗脱,比如乙腈初始比例20-30%,逐步升高到75%-80%,看峰形的变化,来调整洗脱的梯度斜率。

检测器可以用UV或VWD,波长254nm。色谱柱的柱温也是要调整到适合程度,比如30℃,如果峰形比较稍微拖尾或分不开,可以升到40℃,看峰形的变化,是否分开等。柱温的设置范围是有限的,当调整柱温无法满足分离或改善峰形,可通过调整流速,进样量,有机相比例等条件来完成。需要综合考虑,也要对每个条件的变化范围以及可能带来的改变比较熟悉。


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