藻类的种类很多,总体上来看,它们包含的色素有叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素(叶黄素、β胡萝卜素等)、藻红素、藻蓝素等。基本上所有的藻类都含有叶绿素a,它的核心作用就是转化光能,类胡萝卜素是在光合作用中起着辅助功能。一般在绿藻中,会含有叶绿素b,它主要是辅助光合作用,传递能量。在红藻、蓝藻中,藻胆素(藻红素和藻蓝素)也是起着光合辅助作用,使得藻类显出对应的颜色。
就藻类本身来说,不同色素能吸收不同波长的光,把光能转化为化学能,制造有机物并释放出氧气。藻类很多色素本身不参与光合反应,但能把吸收到的光能传递给叶绿素a,让它来完成核心的光合作用。同时,它们能保护细胞免受强光的伤害,调节生长和发育过程。比如,叶黄素和藻胆素能吸收多余的光能转化为热能散失掉,避免产生破坏性的单线态氧。同时,可清除强光产生的活性氧(ROS),保护叶绿素、蛋白质和脂质等。
检测藻类色素的方法,实验室常用分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、荧光光谱法、薄层色谱法等。这里以HPLC为例,简单的介绍一下检测过程。
前处理:藻类细胞壁是比较坚韧的,要先破壁,才能释放出其中的色素。常用的方法有研磨(液氮冷冻后研磨成粉末),匀浆,超声破碎。操作过程中,需要避光、低温,防止色素光解或热降解。色素的提取,要采用有机溶剂(如甲醇、二氯甲烷等)或混合溶剂(如甲醇:二氯甲烷=3:1)。超声的时候注意温度、时间、功率,对应不同种类的样品,采用对应的参数。结束后,用10000r/min去除细胞碎片和不溶物,取上清液氮吹浓缩,用甲醇复溶到适合的体积,过0.22um的膜,待测。
色谱条件:藻类色素如β胡萝卜素,流动相需要用抗氧化剂。否则,在室温的条件下,容易发生降解,导致色谱峰小或检测不出。紫外检测器,波长450nm,可参考药典方法或其他相关分析标准。β胡萝卜素是非极性化合物,可用C18反相色谱柱,它难溶于水,流动相可用88%甲醇水和0.1%BHT-MTBE,梯度洗脱。如果组分简单,测β胡萝卜素,可用等度洗脱。标准品要用棕色容量瓶,加入适量的四氢呋喃,超声溶解后,用0.1%BHT甲醇定容到刻度,并梯度稀释成5-7个浓度点,确保线性范围。