ATP主要来源有糖酵解（无氧呼吸），葡萄糖在细胞中被分解为丙酮酸，产生少量的ATP。在柠檬酸循环中，丙酮酸进入线粒体，通过氧化生成NADH和FADH2，间接促进ATP生成。在线粒体的内膜上，NADH和FADH2通过电子传递链驱动，合成ATP。另外，在植物光合作用中，光能也能被利用合成ATP。ATP是细胞的直接能量来源，通过水解高能磷酸键释放能量，驱动肌肉伸缩和神经传导。每分子的ATP水解可释放出7.3千卡/摩尔能量，钠钾泵每运输3个钠离子需消耗1个ATP。ATP还参与糖酵解、蛋白质合成等生化反应，提供能量支持。
组成ATP的核心单元是腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团。三个磷酸基团在生理条件下去质子化，形成4个负电荷（α，β，γ磷酸各带-2，核糖羟基-1，整体净电荷-4）。四个负电荷空间高度集中，产生强烈的静电排斥，使得ATP4-处于高能亚稳状态，为水解提供了动力。水解前，ATP4-的共振结构数减少，电子离域受限，能量较高。水解后，产物（如ADP3-）拥有更多共振杂化形式，电子云分布更广、更稳定。能量释放过程，就是从较少的共振结构变成较多的共振结构。
用HPLC测定ATP的含量，通过高氯酸从样品提取。2.5%的高氯酸能迅速破坏细胞壁，释放出ATP，特别适合生物组织或细胞样品。同时，它能沉淀蛋白质等大分子，减少对色谱柱的污染。需要注意浓度的控制，避免过高造成ATP的分解。另外，提取后溶液中酸的浓度较高，需要通过KOH调节pH值到中性，才能进行后续的提取和分析测试。高氯酸处理后的溶液，低温超声和高速离心的方法，可以获得相对纯净的溶液，过0.45um膜，液相色谱测定。
由于ATP是相对极性的化合物，可采用极性色谱柱（比如TSKgel ODS-100V，250mmx4.6mm;5um），可比较好的吸附，用0.035mol/L 磷酸二氢钠（pH=6.8）等度洗脱，紫外波长260nm，进样量10ul，柱温25℃，流速1ml/min。