测定油菜素甾醇(BR)的含量,主要包括植物的来源、物理和化学性质、仪器分析、含量计算等。
油菜素甾醇是一种重要的植物激素,它主要来源于被子植物、裸子植物、低等植物等,分布于植物的幼嫩生长组织、种子、花粉、花冠、根和茎等。油菜素甾醇能够直接刺激植物细胞的分裂和伸长,促进根、茎、叶等器官的生长。还通过调节植物生理代谢,提升对低温、干旱、盐害、病害等非生物和生物胁迫的抵抗能力。调控信号传导和基因表达,协同内源激素平衡,提升农作物产量和种子活力。
油菜素甾醇类化合物具有4个碳环的甾醇骨架和特定侧链结构,是一种非极性化合物,表现为不溶于水,但易溶于甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮等多种有机溶剂。可以用C18色谱柱来吸附,流动相来分离,可以串联质谱(LC-MS/MS)测定。前处理包括液氮研磨,有机溶剂提取(如异丙醇、二氯甲烷),氮气吹干、复溶和过滤等步骤。
植物样品使用液氮研磨,称取0.3g(使用万分之一天平)放入到15ml的离心管中。接着要进行混合步骤,加入5ml的异丙醇和水的混合物(加1%的甲酸),混匀2min。混合后接着要进行分离,分离的方法这里用4℃的超声提取1h,将浸提液用10000r/min离心10min得到上清液。分离步骤还没结束,再加入1ml的二氯甲烷,低温超声提取30min,再10000r/min离心10min,重复分离提取一次,合并上清液。室温下,氮气减压到水相,定容至1ml,振荡混匀。这个过程没有涉及到加热,是因为油菜素内酯对温度敏感,需要在低温下进行提取。之后,用甲醇溶解,并0.22um膜过滤。
色谱条件是C18反相色谱柱,用长度为100mm,2.1mm内径,1.7um粒径的规格。柱温一般用35℃,流速为0.3ml/min,流动相梯度为0.1%甲酸水和乙腈,梯度洗脱。在质谱方面,离子模式为ESI±模式,喷雾电压为+5500V,-4500V,离子源温度450℃,离子对参数用BR的。