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亚精胺含量检测方法

2025-08-28

亚精胺是生物体通过腐胺和腺苷甲硫氨酸的生物合成,最终合成亚精胺。化学式为C7H19N3,分子量145.2,可溶于水、醇和醚,沸点246.6±8.0℃。亚精胺可抑制神经元合成酶,结合并沉淀DNA;也可用于纯化DNA结合蛋白,刺激T4聚核苷酸激酶活性。从科研的角度来看,亚精胺可以促进细胞增殖,增强DNA的稳定性和柔韧性。

检测样品中的亚精胺含量,常用的方法包括高效液相色谱(HPLC)法、质谱(MS)法、荧光光谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。

1.高效液相色谱(HPLC)法

样品提取:将样品粉碎研磨,取5g放在50ml离心管中。加入0.4mol/L的高氯酸,振荡萃取5min,静置5min,离心30-35min。接着,用高氯酸溶液提取。衍生化,用0.45um过滤。

HPLC色谱条件:采用C18的色谱柱,柱温根据实际情况调整。以甲醇和水为流动相,流速为0.5-1.0ml/min,紫外检测器,波长210-254nm之间,进样量10-20ul。根据样品和设备的情况,选择适当的参数。有文献参考的方法,也有标准的方法,除了验证,还可以自己开发出来一套方法。

标准曲线:将标准品进行梯度的,成倍数的稀释,至少6个浓度点。在适当的HPLC色谱条件下,依次上机测定色谱峰。在测定的过程中,观察出峰的情况。正常的时候,以色谱峰面积为纵坐标,色谱峰对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程,计算回收率。标准曲线的相关系数r2>0.999,确保重复性在规定的范围内。

样品检测:样品测定过程和标准溶液相似的,不同的是,样品可能需要稀释一定的倍数,让峰在屏幕上有适当的位置,不能过低也不能过高。更重要的是,样品里面的化合物,有可能会影响到出峰的情况。也就是说,标准品出的峰是正常的,而到了样品化合物的时候就变形了。其实,这就是要考虑样品对色谱柱,流动相,检测器等方面的影响,或者温度和进样量等。检测出来的色谱峰,按色谱峰面积和标准曲线,计算出样品中的亚精胺含量。

采用内标或外标法,一般采用标准曲线的方法测定。

3.质谱(MS)法

质谱一般是和液相或气相联用的,测亚精胺一般用电喷雾离子化方法,质谱分析模式用选择反应监测(SRM)或多反应监测(MRM),在正离子采集模式下。不同浓度的亚精胺标准品,建立标准曲线,以便进行定量分析。标准曲线的相关系数r2>0.999,以确保结果的准确性。

4.酶联免疫吸附(ELISA)法

采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测方法。向预包被了抗体的微孔板中,加入标准品和待测样本,温育后,加入生物素标记抗体和过氧化物酶标记的亚精胺。经过温育和洗涤结合形成的免疫复合物,去除未结合的酶,然后加入显色底物TMB。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子浓度呈正相关。最后,在450 nm处测定反应孔样品吸光度(OD)值,通过绘制标准曲线计算出样本亚精胺的浓度。按试剂盒的说明书要求和注意事项,完成操作。


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