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环磷酸腺苷(cAMP)检测方法

2025-08-22

cAMP是3,5-环腺苷酸,是一种有机物,是细胞内的第二信使。也就是二传,当第一信使激活了腺苷酸环化酶,就催化ATP环化形成。因此,它的信号能不能传递,是否继续,是要依赖于蛋白激酶A的。当然,cAMP在有的微生物中,也参与了转录调控的作用。它的作用,主要是调节细胞内的物质代谢和生物学功能,在临床方面也有一定的研究。从病理学角度来看,cAMP和一些疾病的产生,传导了有效的信号。

检测cAMP的方法有很多,其中包括了高效液相色谱(HPLC)法,酶联免疫吸附(ELISA)法。

1.高效液相色谱(HPLC)法

HPLC测定cAMP含量,需要经过前处理,色谱条件,样品测定,标准曲线,含量计算等步骤。利用样品中化合物在固定相和流动相之间的分配系数差异,进行分离和测定。

色谱条件:C18的色谱柱,柱温30℃;流动相:A相为磷酸盐缓冲液,B相为乙腈,洗脱方式需要根据实验来定,流速1.0ml/min;紫外检测器,波长258nm;进样量10-20uL,仅供参考。一般情况下,要对方法进行验证。

标准曲线:对标准品进行溶解,梯度稀释至少5-7个点,最低点要是检测限的5倍左右。上机测定,出现色谱峰。以标准溶液的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程,要r2>0.999,以确保线性。重复性和回收率也是需要考虑的。

样品测定:样品的测定,和标准品的操作是相似的。如果怕标准品污染,可以先测样品。根据测定出来的色谱峰,对面积进行积分,根据回归方程,计算出含量。

2、酶联免疫吸附试验(ELISA)

往预先包被环磷酸腺苷(cAMP)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的环磷酸腺苷(cAMP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。


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