丙酮酸是糖酵解过程的关键中间产物,在肌肉中会转化为乳酸,或通过三羧酸循环,参与到细胞的能量代谢。是许多生物合成途径的前体,可转化为氨基酸,脂肪酸和糖原等。当出现饥饿的时候,丙酮酸会起到调节作用,帮助维持血液酸碱平衡。丙酮酸具有一定的抗氧化作用,减少自由基的产生,保护细胞免受氧化应激的影响。在细胞内,丙酮酸可以作为信号分子,通过影响酶的活性,参与细胞的生长、分化和凋亡等过程。丙酮酸还参与脂肪酸的合成和分解,维持脂肪的代谢平衡。
丙酮酸有3个碳,属于三碳酸类化合物,具有特殊的果香气息。化学结构为CH3COCOOH,包含1个酮基(C=O)和1个羧基(COOH),具有强烈的酸性,能和碱反应生成丙酮酸盐。溶于水、氯仿和甲醇,但不溶于 二乙醚。通过醛缩反应转化为 丙酮 和 碳酸酯,在还原剂的作用下被还原为丙醇 ,并且在加热条件下能够脱水生成丙烯酸。
测定生物组织中丙酮酸含量的方法,常用到高效液相色谱(HPLC)。
1.样品处理
称取样品4g,放入15min离心管中,加入5ml的水,4℃超声30min,4℃冰箱静置2h,取出4000r/min离心10min,定容10ml后0.45um膜过滤待测。
2.色谱条件
C18色谱柱,250*4.6mm,5μm,柱温30℃;紫外检测器或VWD,波长210nm;流速1ml/min,10-20uL。0.1%磷酸水:甲醇=97.5:2.5为流动相,等度洗脱,或采用乙腈-磷酸二氢钾(梯度洗脱)。
3.标准曲线
确定标准曲线的时候,需要对标准品溶解并进行成倍的稀释,大约5-7个点,一般用6个浓度。要进行脱气处理,进样的HPLC测出各个浓度的色谱峰,记录保留时间,对色谱峰面积积分,对应这个峰的浓度,拟合标准曲线,得到回归方程,相关系数需要1>R2>0.999。
4.含量计算
将样品溶液按对应的体积要求,可以手动进样,也可以自动进样。根据保留时间,确定出样本的目标色谱峰,对这个色谱峰面积进行积分,代入到回归方程,可以计算出样本溶液中的丙酮酸含量。