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天冬酰胺含量测定方法

2025-08-18

天冬酰胺主要来源于植物,比如羽扇豆、大豆以及豆芽的水提取物中。通过氨基酸的酰胺反应,也可以通过人工的方式合成天冬酰胺。L-天冬酰胺是一种天然存在的化合物,化学式为C4H8N2O3,分子量为132.12,是生物体内常见的20种氨基酸之一。天冬酰胺是由4个碳原子组成的,侧链为酰胺基,和天冬氨酸相比少一个羧基(COOH)。它是蛋白质的基本组成单元之一,稳定蛋白质的结构,参与氮代谢和能量供应,是神经递质的前体,可提高免疫细胞活性,具有抗氧化等作用。

检测样品中的天冬酰胺含量的方法,一般包括高效液相色谱(HPLC),液相质谱联用(LC-MS),酶联免疫吸附(ELISA)法等。这里以HPLC为例,简单的介绍一下检测流程。

1.样品处理

这个步骤包括了水解和衍生两个过程。水解就是将样品中的目标化合物溶解到溶剂中,比如称取0.1g的样本,加入1ml的6mol/L的盐酸,振荡5min。之后,放到105℃的烘箱中水解24h。水解结束后,冷却到室温,用盐酸补充丢失的部分。加入1ml的6mol/L的NaOH溶液,振荡5min中和到中性,在4000r/min的离心10min,取0.5ml出来进行衍生。

衍生的过程,就是将取出来的0.5ml的样本溶液,加入pH=9.0 碳酸氢钠缓冲溶液和DNFB各0.5ml,放入60±0.5℃水浴中,避光反应60min。取出立即用冷水冷却至室温,加入3.5ml pH=7.0磷酸缓冲溶液,充分混匀,室温避光反应15min,取上清液过0.22μm 滤膜,待液相色谱测定。

2.色谱条件

用C18的色谱柱,250mm长,4.6mm内径,5um的粒径;柱温设置为38℃。用VWD检测器,波长360nm。以A:乙腈:甲醇=90:10 B:0.02mol/L磷酸二氢钠+磷酸氢二钠为流动相,梯度洗脱。流速1ml/min,进样量10uL。

3.标准曲线

称取少量的标准品,溶于甲醇中,制备成一定浓度的标准母液。梯度稀释6个浓度点,并进样到HPLC中,测出各个浓度的色谱峰。对峰的面积进行积分,结合它的浓度,在表格中可以拟合出标准曲线,得到回归方程。相关系数r2要大于0.999,并接近于1。重复性RSD≤2%,有的时候要考虑回收率。

4.含量计算

将样品溶液进到HPLC,根据标准品的保留时间,找到目标化合物的峰。对色谱峰面积进行积分,代入到回归方程,就可以计算出样品溶液中的天冬酰胺的含量。


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